Geelielektroforeesi: DNA:n ja proteiinien erottelun perusteet
Geelielektroforeesi: opas DNA:n ja proteiinien erotteluun — selkeät periaatteet, sähkökentän vaikutus ja käytännön vinkit opiskelijoille ja laboratorioon.
Geelielektroforeesi on laboratoriotekniikka, jota käytetään DNA:n ja proteiinien kaltaisten seosten erottamiseen. Erottelu perustuu molekyylien varaukseen ja kokoon: varautuneet molekyylit liikkuvat sähköisesti aiheutetussa kentässä ja gelin huokosrakenteen vuoksi pienemmät molekyylit kulkevat yleensä nopeammin kuin suuret. Geelielektroforeesissa käytetään geeliä (esimerkiksi agaroosia tai polyakryyliamidia), ja geelin läpi johdetaan sähkökenttä. On hyvä huomata, että vaikka arkikielessä sana "geeli" voi viitata moniin hyytelömäisiin aineisiin, laboratorioelektroforeesissa käytetään yleensä agaroosia tai polyakryyliamidia; gelatiinia ei tyypillisesti käytetä tähän tarkoitukseen.
Periaate
Liikkeen suunta ja nopeus: DNA-molekyylit ovat yleensä negatiivisesti varautuneita fosfaattiketjunsa takia, joten ne liikkuvat kohti positiivista napaa. Geelin huokoset toimivat seulan tavoin: pienemmät fragmentit liikkuvat huokosten läpi nopeammin ja etääntyvät enemmän lähtöpaikastaan kuin suuret fragmentit.
Käytetyt gelityypit
- Agaroosigeeli – yleinen DNA-fragmenttien erotteluun (esim. 0,5–2 % agaroosia riippuen fragmenttien koosta).
- Polyakryyliamidi (PAGE) – suurempi erotuskyky, käytetään erityisesti pienille DNA-paloille ja proteiineille (SDS-PAGE proteiinien denaturoivaan erotteluun).
- Native-PAGE – proteiinien erottelu ilman denaturointia, jolloin säilyy niiden alkuperäinen muoto ja varaus.
Yleinen menettely
- Valmistele geeli: liuota agaroosi sopivassa puskurissa (esim. TAE tai TBE), kaada muottiin ja anna jähmettyä.
- Lisää näytteisiin kuormitusväriaine (loading dye) ja tarvittaessa denaturantti (esim. SDS proteiineille).
- Lataa näytteet geelin koloihin ja lisää DNA- tai proteiinistandardi (ladder) vertailua varten.
- Aseta geeli elektroforeesikammioon ja johda sähkökenttä. Aseta napaisuudet oikein (esim. DNA liikkuu kohti anodia).
- Juoksuta geeli sopivalla jännitteellä ja ajalla, värjää ja visualisoi nähden ruudussa tai UV-/sinivalolaitteella.
Värjäys ja visualisointi
Tavallisia DNA-väriaineita ovat etidiumbromidi (herkästi fluoresoi UV-valossa, mutta on mutageeninen) ja turvallisemmat vaihtoehdot kuten SYBR Safe. Proteiineille käytetään esimerkiksi Coomassie-sinistä tai hopeavärjäystä herkempään analyysiin. Käytä aina asianmukaisia suojavälineitä ja vältä suorassa silmäkontaktissa UV-valoa.
Sovellukset
- DNA-palaresoluutio, kuten PCR-tuotteiden tarkastus ja genoottinen profilointi
- Plasmidi- tai genomisten fragmenttien koon arviointi
- Proteiinien puhtauden ja molekyylipainon arviointi (SDS-PAGE)
- Elektroforeettinen separaatio ennen jatkoanalyysejä, kuten leikkausta, sekvensointia tai massaspektrometriaa
Turvallisuus ja yleiset ongelmat
Huomioi seuraavat seikat:
- Väriaineet: Etidiumbromidi on mutageeninen — käsittele huolellisesti ja hävitä asianmukaisesti. Käytä tarvittaessa turvallisempia vaihtoehtoja.
- Sähkö: Kytketty elektroforeesilaitteisto on jännitteinen — sammuta virta ennen koskettamista.
- Häiriöt: Hajanaiset tai smeared-bändit voivat johtua DNA:n hajoamisesta, liiallisesta näytemäärästä, virheellisestä puskurista tai liian korkeasta jännitteestä. "Smiling"-efekti (bändien kaareutuminen) liittyy yleensä epätasaiseen lämpötilaan tai geelin reunoilla tapahtuvaan lämpenemiseen.
Tulkinta
Arvioi näytteiden koko vertaamalla niitä kokostandardiin (ladder). Selkeät, terävät bändit kertovat hyvästä erottelusta ja näytteen eheydestä; useampi bändi voi viitata seokseen tai täysimittaiseen monomorfismiin. Jos bändejä ei näy, tarkista näytteen lataus, puskurin koostumus, väriaineiden käyttö sekä laitteiston napaisuudet.
Sana elektroforeesi tulee sanoista -electro, koska käytetään sähköistä kenttää, ja -phoresis, joka tarkoittaa liikettä. Menetelmä on yksinkertainen mutta joustava, ja sitä muokkaamalla voidaan ratkaista monenlaisia biologisia kysymyksiä.
Geelielektroforeesilaite . Seos asetetaan kuoppaan. Geeliä pidetään kiinni levyillä. Sähkökenttä saa aikaan sen, että geelissä on positiivinen ja negatiivinen puoli vastakkaisissa päissä...
Gel
Geeli koostuu suurista ja haarautuneista molekyyleistä, joita kutsutaan polymeereiksi. Haarojen määrä geelissä määrää, kuinka helposti molekyylit mahtuvat puristumaan sen läpi, riippuen niiden koosta.
Jos haaroja on paljon, pienet molekyylit pääsevät helposti läpi, kun taas suuret molekyylit liikkuvat hitaasti tai eivät ollenkaan. Jos haaroja on vähän, sekä suuret että pienet molekyylit voivat liikkua helpommin.
Molekyylin varaus
Jos suurella molekyylillä on suuri varaus, sen vetovoima vastakkaiseen varaukseen on myös suuri. Mutta koska molekyyli on suuri, sen on vaikea liikkua paksun geelin läpi. Geelielektroforeesissa suuret molekyylit liikkuvat hitaammin.
Pieni varattu molekyyli liikkuu geelin läpi helpommin. Lyhyemmät molekyylit liikkuvat nopeammin ja kauemmas kuin pidemmät, koska lyhyemmät molekyylit pääsevät helpommin geelin huokosten läpi. Tätä ilmiötä kutsutaan siivilöinniksi.
Jos molekyylillä ei ole varausta, se ei liiku.
Ultraviolettilampun (UV) alla näkyvä geelilohko. Kaistaleet on värjätty punaisiksi
Visualisointi
Kun geeli on ajettu sähkökentän avulla, voit katsoa, mihin molekyylit ovat siirtyneet. Tätä varten geeliin voidaan levittää erilaisia väriaineita: näin molekyylit voidaan nähdä. Värjäys saa paikat, joihin molekyylit ovat siirtyneet, näkymään värillisinä kaistaleina. Proteiinien tarkasteluun käytettävät väriaineet, kuten Coomassie-sininen, näkyvät usein ihmissilmällä tavallisessa valossa. DNA:n tarkasteluun käytettävät väriaineet, kuten etidiumbromidi ja GelGreen, voidaan nähdä vain ultraviolettilampun avulla.
Sovellukset
DNA:n erottelu
Geelielektroforeesi on yleisimmin käytetty tekniikka DNA:n tutkimiseen. DNA on hyvin suuri molekyyli, joka sisältää geneettistä tietoa. DNA voidaan pilkkoa pienemmiksi erikokoisiksi paloiksi, jotka erotetaan toisistaan geelielektroforeesin avulla. DNA:lla on aina negatiivinen varaus, ja se liikkuu kohti anodia.
Proteiinit ovat suuria ja monimutkaisia molekyylejä, jotka koostuvat aminohapoista. Proteiineja voidaan tutkia geelielektroforeesilla kahdella tavalla. Yksi tapa on ottaa proteiinien seos ja erottaa ne geelissä. Toinen tapa on hajottaa yksittäinen proteiini pienempiin osiin. Pienemmät palat voidaan sitten erottaa geelissä. Proteiinit voivat olla positiivisesti tai negatiivisesti varautuneita. Jos proteiinit halutaan erottaa toisistaan vain koon perusteella, proteiiniseokset voidaan päällystää natriumdodekyylisulfaatiksi (SDS) kutsutulla kemikaalilla, jolloin kaikki proteiinit saavat negatiivisen varauksen ennen seoksen asettamista geeliin.
Lääketiede
Lääketieteessä on olemassa erityyppinen elektroforeesi, jota kutsutaan iontoforeesiksi. Iontoforeesissa käytetään samaa geelielektroforeesin ideaa lääkkeiden antamiseksi ihmiskehoon ihon läpi ilman, että lääkettä ruiskutetaan neuloilla.
Kysymyksiä ja vastauksia
K: Mikä on geelielektroforeesi?
V: Geelielektroforeesi on tekniikka, jota käytetään DNA:n ja proteiinien kaltaisten seosten erottamiseen niiden varauksen ja koon perusteella.
K: Miten geelielektroforeesi toimii?
V: Geelin läpi johdetaan sähkökenttä, ja molekyylit siirtyvät geelin läpi varauksensa ja kokonsa perusteella, jolloin seos erottuu toisistaan.
K: Mitä termi elektroforeesi tarkoittaa?
V: Sana elektroforeesi tulee sanoista electro, joka tarkoittaa sähkökenttää, ja -phoresis, joka tarkoittaa liikettä.
K: Minkä tyyppisiä molekyylejä erotetaan geelielektroforeesin avulla?
V: DNA:n ja proteiinien seokset erotetaan yleensä geelielektroforeesilla.
K: Mikä on geelin rooli geelielektroforeesissa?
V: Geeli tarjoaa väliaineen, jossa molekyylit voivat siirtyä varauksensa ja kokonsa perusteella.
K: Miten erottelu saadaan aikaan geelielektroforeesilla?
V: Erottelu saavutetaan kohdistamalla geeliin sähkökenttä, joka saa molekyylit vaeltamaan geelin läpi ja erottamaan ne toisistaan niiden varauksen ja koon perusteella.
K: Miksi geelielektroforeesi on hyödyllinen?
V: Geelielektroforeesi on hyödyllinen DNA:n ja proteiinien seosten erottamisessa ja analysoinnissa, minkä ansiosta tutkijat voivat paremmin ymmärtää biologisia prosesseja ja diagnosoida sairauksia.
Etsiä