Käänteinen transkriptaasi — määritelmä, toiminta ja merkitys

Käänteinen transkriptaasi — selkeä määritelmä ja toimintamekanismi RNA:sta DNA:ksi, cDNA:n synty sekä merkitys tutkimuksessa, diagnostiikassa ja lääketieteessä.

Käänteinen transkriptaasi on entsyymi, joka toimii "taaksepäin" RNA:sta DNA:ksi. Normaalissa transkriptiossa RNA:ta syntetisoidaan DNA:sta, käänteisessä transkriptiossa tämä tapahtuu päinvastoin. Se on DNA-polymeraasientsyymi, joka transkriboi yksijuosteista RNA:ta yksijuosteiseksi DNA:ksi. Se syntetisoi myös toisen DNA-juosteen, joka on komplementaarinen käänteisesti transkriptoidun yksijuosteisen cDNA:n kanssa.

Toimintamekanismi ja rakenne

Käänteisen transkriptaasin perustoiminto on RNA-templaatin käyttäminen DNA:n synteesiin. Useimmilla tunnetuilla käänteisillä transkriptaaseilla on kaksi päätoimintoaluetta:

• DNA-polymeraasi — rakentaa DNA-juostetta RNA-mallin päälle.
• RNase H — pilkkoo RNA:ta RNA–DNA-hybrideistä, jolloin RNA-templaatti voidaan poistaa ja syntetisoida toinen DNA-juoste.

Useimmat retrovirusten käänteiset transkriptaasit tarvitsevat alukkeen (primer) käynnistämään synteesin; retroviruksissa alukkeena toimii usein isäntäsolun tRNA. Entsyymi on tyypillisesti monialkioinen ja siinä esiintyy useita domeeneja, jotka vastaavat polymeraasitoiminnosta ja RNase H -toiminnosta. Käänteiset transkriptaasit ovat yleensä virheherkempiä kuin soluissa esiintyvät DNA-polymeraasit, koska niiltä usein puuttuu 3'→5' korrektioeksimulaatio (proofreading).

Esimerkkejä ja tyypit

Hyvin tutkittuja käänteisiä transkriptaaseja ovat mm:

• HIV-1:n käänteinen transkriptaasi (ihmisen immuunikatovirus 1) — tärkeä kohde HI-viruslääkkeille ja laajasti tutkittu.
• Moloney murine leukemia virus (M-MuLV) -käänteinen transkriptaasi — yleisesti käytetty laboratorioreagensseissa cDNA-synteesissä.
• Avian myeloblastosis virus (AMV) -käänteinen transkriptaasi — myös usein käytetty tutkimuksessa.
• Telomerase (TERT) — totutusta poiketen telomeraasin katalyyttinen osa käyttää sisäistä RNA-templaattia telomeerijaksojen lisäämiseen; se kuuluu käänteisen transkriptaasin perheeseen, vaikkakin toimii solun omassa kromosomien ylläpidossa.

Biologinen ja lääketieteellinen merkitys

• Retrovirusten elinkaari: Käänteinen transkriptaasi on välttämätön retrovirusten replikaatiossa: RNA-genomi käännetään ensin DNA:ksi, joka integroituu isäntäsolun genomiin ja mahdollistaa viruksen pysyvän lisääntymisen.
• Genomin muuntelu: Retrotransposonit ja retrovirusjäänteet levittävät ja muokkaavat isäntäorganismin genomia evoluution aikana.
• Virusten nopea muuntelu: Entsyymin virhealtis toiminta johtaa suurempaan mutaatiotaajuuteen retroviruksissa, mikä selittää esimerkiksi HIV:n nopean resistenssin kehittymisen lääkehoidolle.
• Diagnostiikka ja hoito: Käänteistä transkriptaasia hyödynnetään laboratoriomenetelmissä (ks. alla) ja samaan aikaan se on keskeinen lääkekohde HIV-hoidossa (esim. NRTI- ja NNRTI-luokan lääkkeet).

Lääkkeet ja esto

HIV-hoidossa käytetään käänteistä transkriptaasia estäviä lääkkeitä, kuten:

• Nukleosidi-/nukleotidianalogiset estäjät (NRTI): nämä integroituvat kasvavaan DNA-ketjuun ja aiheuttavat ketjun terminoinnin (esim. zidovudiini, lamivudiini).
• Ei-nukleosidiset estäjät (NNRTI): sitoutuvat suoraan entsyymiin ja muuttavat sen konformaatiota, mikä estää polymeraasitoimintaa (esim. efavirentsi).

Resistenssi syntyy usein yhden tai muutaman emäsmutaatioiden seurauksena, koska entsyymi on virhealtis.

Käyttö molekyylibiologiassa

• cDNA-synteesi: Käänteistä transkriptaasia käytetään RNA:ssa olevien geenien kääntämiseen cDNA:ksi, jota voidaan sen jälkeen monistaa ja sekventioida.
• RT-PCR ja qRT-PCR: RNA-pohjaisten analyysien perusta — RNA käännetään DNA:ksi ja sitä amplifioidaan polymeraasiketjureaktiolla, mikä mahdollistaa altistuksen ja kvantitoinnin (mm. viruskuorman mittaus).
• cDNA-kirjastot ja genien ilmentymistutkimukset: Käänteinen transkriptaasi on välttämätön näiden menetelmien perustamisessa.

Historia

Käänteisen transkriptaasin löysi riippumattomasti Howard Temin ja David Baltimore 1970-luvun alussa. Löydös oli niin merkittävä, että heille myönnettiin Nobel-palkinto vuonna 1975. Löytö muutti käsityksemme geneettisen informaation suunnasta ja avasi uusia polkuja molekyylibiologialle ja virusopin tutkimukselle.

Turvallisuus ja huomioitavaa

Laboratoriokäytössä käänteiset transkriptaasit voivat olla peräisin viruksista, joten on tärkeää noudattaa asianmukaisia biosafety-käytäntöjä. Lisäksi diagnostisissa testeissä ja tutkimuksessa käytetään usein rekombinantteja, ei-viruksia lähteitä sisältäviä entsyymejä.

Yhteenvetona: käänteinen transkriptaasi on keskeinen entsyymi sekä luonnon ilmiöissä (retrovirukset, retrotransposonit, telomeraasi) että bioteknisissä sovelluksissa (cDNA-synteesi, RT-PCR). Sen ominaisuudet — erityisesti kyky käyttää RNA:ta DNA:n mallina ja suhteellisen korkea virheprofiili — tekevät siitä sekä tutkittavan kohteen että tärkeän lääkekohteen.

Hae kirjaimella