Valikoiva merkkigeeni – määritelmä, antibioottiresistenssi ja esimerkit

Valikoiva merkkigeeni – selkeä määritelmä, antibioottiresistenssin merkitys ja käytännön esimerkit geenitutkimuksessa. Lue, miten merkkiaineet varmistavat transfektion onnistumisen.

Valikoiva merkkiaine on reportterigeeni, joka tuodaan soluun yhdessä geeni-insertin kanssa. Tämä tarkoittaa sitä, että kokeen suorittaja voi sanoa, että solussa on oikea geeni, koska merkkiaine voidaan nähdä tai havaita. Valikoiva merkkiaine antaa soluille valitsevan edun tietyissä olosuhteissa, jolloin vain muutetut solut selviävät tai kasvavat valintapaineen alla.

Useimmiten tätä käytetään bakteereille tai soluviljelmissä oleville soluille. Valikoituvat merkkiaineet osoittavat transfektion tai muun vieraan DNA:n siirtämiseen soluun tarkoitetun menettelyn onnistumisen. Se on tekniikka geenien kohdentamisessa ja geenien tyrmäyksessä. Kun valinta tapahtuu oikein, vain ne solut, jotka ovat ottaneet vastaan tai integroituneet haluttuun DNA:han, säilyvät ja voidaan jatkokäsitellä.

Miten valikoiva merkkigeeni toimii

Yleisin tapa valinnalle on antibioottivalinta: soluille annetaan antibiootti tai muu valinta-aine, joka tappaa tai estää normaalisti kasvamasta ne solut, joilla ei ole valintageeniä. Valintageeni voi toimia eri mekanismein, esimerkiksi:

• entsymaattinen inaktivaatio (esim. bla–koodaava beeta-laktamaasi, joka pilkkoo penisilliinityyppisiä antibiootteja),
• antibiootin modifikaatio (fosforylaatio, asetylointi jne.),
• muutokset antibiootin kohdemolekyylissä tai tehokkaammat puskuroivat/poistavat pumput,
• metaboliset korvaukset, joissa solun auxotrofia korjataan (esim. URA3- tai LEU2-tyyppiset merkitsijät hiivassa).

Yleisiä valittavia merkkigeenejä (esimerkkejä)

Seuraavassa on tyypillisiä valittavia merkkejä eri järjestelmissä, lyhyine kuvauksineen:

• bla / AmpR (ampisilliini) – beeta-laktamaasi hajottaa beetalaktaamiantibiootit; yleinen bakteerivektoreissa.
• kanR / NeoR (kanamysiini / G418) – koodaa aminoglykosidifosfotransferaasia; käytetään sekä bakteereissa että eukaryooteissa (G418-valinta).
• cat / CmR (kloramfenikoli) – kloramfenikoliasetylitransferaasi inaktivoi kloramfenikolin bakteereissa.
• tetR (tetrasykliini) – konformaatiomuutosten tai pumppujen kautta resistenssiä; tetrasykliinijärjestelmiä käytetään myös säätelyssä.
• hph (hygromycin) – hygromysiini B fosfotransferaasi; laajasti käytetty solulinjojen valinnassa eukaryooteissa.
• pac / puroR (puromysiini) – puromysiinin N-acetyltransferaasi; nopea valinta mammalisoluissa.
• bar / PAT (glufosinaatti / bialaphos) – käyttö kasveissa (resistenssi fosfinotiaatti-tyyppisille aineille).
• URA3, LEU2, TRP1, HIS3 – hiivan auxotrofia-merkitsijät, joissa valinta tapahtuu kasvualustan aminohappolisäyksillä tai niiden puutteella.
• zeoR, bsd, natR – muita antibioottivasteita (Zeocin, blasticidin, nourseothricin) käytetään erilaisissa soluissa.

Seulottavat ja vastavalinnat (screening ja counter-selection)

Valittavien merkkiaineiden vaihtoehto on seulottava merkkiaine, kuten lacZ (beta-galaktosidaasi) tai fluoresoivat proteiinit (esim. GFP), joiden avulla tutkija voi erottaa halutut ja ei-toivotut solut visuaalisesti tai virtaus-sytometrialla ilman antibioottivalintaa. Lisäksi käytetään negatiivista valintaa / counter-selection, jossa markerin ilmentäminen tekee solusta herkän tietylle aineelle (esim. sacB suolistobakteereissa tekee solusta herkän saharoosille; HSV-TK tekee solusta herkän gansikloviirille). Negatiivinen valinta on hyödyllinen, kun halutaan poistaa valintageeni jälkikäteen tai valita kotoutuneita integroituneita tapahtumia.

Tekniset ja turvallisuusnäkökohdat

Valittavien merkkigeenien käyttöön liittyy useita käytännön ja eettisiä huomioita:

• Bioturvallisuus: antibioottiresistenssigeenien laajamittainen käyttö nostaa huolta geenien mahdollisesta siirtymisestä ympäristöön tai patogeeneihin. Siksi laboratoriokäytössä noudatetaan jätesuunnitelmia ja rajoituksia.
• Markerin poisto: joissakin sovelluksissa halutaan lopputuotteeseen geenimuutos ilman valintageeniä. Tällöin käytetään 'marker recycling' -menetelmiä, kuten rekombinaatio- ja rekombinaasijärjestelmiä (Cre/loxP, FLP/FRT) tai CRISPR-pohjaisia leikkauksia.
• Valinnan tehokkuus: oikea antibiootin annostelu ja aika ovat kriittisiä — liian alhainen pitoisuus sallii ei-muuttuneiden solujen kasvun, liian korkea tappaa myös transformoidut solut ennen ilmentymistä.
• Alternatiivit: markerittömät menetelmät, fluoresoivat reporterit sekä metabo­liset valinnat tarjoavat vaihtoehtoja, jotka vähentävät antibioottiresistenssiin liittyviä riskejä.

Yhteenveto

Valikoiva merkkiaine on tehokas työkalu molekyylibiologiassa ja solu­biologiassa: se mahdollistaa transformoitujen tai transggeenien kantavien solujen valinnan ja jatkokäsittelyn. Valinta voi perustua antibioottiherkkyyteen, auxotrofiaan, näkyviin raporttereihin tai negatiiviseen valintaan. Valinnan suunnittelussa tulee kuitenkin huomioida käytännön seikat, turvallisuus ja mahdolliset ympäristövaikutukset, ja tarvittaessa käyttää markerin poisto- tai markerittomia strategioita.

Esimerkkejä valittavista merkinnöistä ovat:

• Ampisilliiniresistenssi (bla / AmpR)
• Kanamysiini/G418-resistenssi (kanR / NeoR)
• Kloramfenikoliresistenssi (cat / CmR)
• Hygromysiiniresistenssi (hph)
• Puromysiiniresistenssi (pac / puroR)
• Kasvien bar/PAT-valinta (glufosinaatti)
• Hiivan auxotrofia-merkitsijät (URA3, LEU2 jne.)

Kysymyksiä ja vastauksia

K: Mikä on valittavissa oleva merkki?

K: Minkä tyyppisissä soluissa valikoivaa merkkiainetta käytetään useimmiten?

K: Mikä on selektiivisten merkkiaineiden tarkoitus?

K: Missä tekniikassa valikoivia merkkiaineita käytetään?

K: Mikä on esimerkki valikoivista markkereista?

K: Miten antibioottiresistenssigeeni toimii selektiivisenä markkerina?

K: Mikä on vaihtoehto valikoivalle merkkiaineelle?

Hae kirjaimella