Transfektio: DNA- ja RNA-siirto soluihin — määritelmä ja sovellukset
Transfektio: selkeä määritelmä ja käytännön sovellukset — DNA- ja RNA-siirrot soluihin, menetelmät, geeniterapia, vaikutukset ja tutkimuskäytöt.
Transfektio on prosessi, jossa DNA:ta tai RNA:ta viedään tarkoituksellisesti soluihin. Sana muodostuu sanoista transformaatio ja infektio. Termiä käytetään mm:
- Bakteerisolujen muuntaminen viruksen nukleiinihapoilla
- Eläinsolujen muuntaminen kudosviljelyssä puhdistetulla DNA:lla. DNA lisätään solujen genomiin.
- Solujen tai alkioiden muuntaminen yksi- tai kaksijuosteisella RNA:lla. Tämä saa aikaan tiettyjen proteiinien rakentamisen tai tiettyjen geenien vaimentamisen.
- Geeniterapia käyttäen muunnettua virusta vektorina.
Transfektio voi johtaa odottamattomiin morfologioihin ja poikkeavuuksiin kohdesoluissa. Transfektio RNA-molekyyleillä saa aikaan muutoksia, jotka eivät voi siirtyä pysyvästi solulinjassa.
Mitä transfektio tarkoittaa käytännössä?
Transfektiossa ulkopuolinen nukleiinihappo (plasmidi-DNA, kromosominen DNA, mRNA, siRNA, shRNA tai CRISPR-komponentit) tuodaan solun sisään siten, että se ilmentyy tai vaikuttaa solun toimintaan. DNA:n kuljetus voi johtaa joko tilapäiseen ilmentymiseen (transient transfection) tai pysyvään muutokseen, jos DNA integroidaan solun genomiin tai valitaan solut, joissa plasmidi säilyy. RNA-transfektio on yleensä ohimenevää, koska solu hajottaa vieraiden RNA-molekyylien ohessa niitä ei yleensä integroidu genomiin.
Yleiset menetelmät
- Kemialliset menetelmät: lipofektio (lipidipartikkeleilla), kalsiumfosfaatti ja muut kaupalliset reagenssit. Nämä ovat helppoja ja sopivat monille solulinjoille mutta voivat olla solutoksisia herkimmille soluille.
- Fysikaaliset menetelmät: elektroporaatio (sähköpulssi solukalvon läpäisemiseksi), mikroinjektio ja pikasuuntaus (nucleofection). Soveltuvat erityisesti vaikeasti transfektoitaville soluille ja primaarisille soluilla.
- Virusvektorit: adenovirus-, adeno-assosioitu virus (AAV), lentivirus jne. Virukset tarjoavat tehokkaan tavan siirtää geenejä in vitro ja in vivo; erotetaan usein termillä transduktio, mutta yhteiskäyttö terminologian kanssa on yleistä.
Sovellukset
- Proteiinien yliekspressio ja funktion tutkimus (esim. GFP-raportit, entsyymitutkimus).
- Geenien vaimentaminen siRNA- tai shRNA-menetelmillä (gene knockdown).
- Geenien muokkaus CRISPR–Cas9-järjestelmällä, jossa komponentit voidaan toimittaa DNA:na, mRNA:na tai ribonukleoproteiinina (RNP).
- Solulinjojen luominen vakaisella ilmentymällä selektion avulla (esim. antibioottiresistenssivektori ja yksisolukloonitus).
- Geeniterapia ja rokkeiden kehitys, jossa viruksia tai ei-virallisia vektoreita käytetään geenihoidon kuljettimiina.
Väliaikainen vs. pysyvä ilmentyminen
Transientissä transfektiossa nukleiinihappo ilmentyy vain lyhytaikaisesti (päiviä–viikkoja) ilman genomista integrointia. Tämä on käyttökelpoinen nopeisiin kokeisiin ja toksisuuden välttämiseksi. Pysyvässä transfektiossa DNA integroidaan luontaisesti tai valitaan solut, jotka ylläpitävät plasmidia, jolloin ilmentyminen jatkuu ja se voi siirtyä tyttärisoluille.
Tehokkuuteen ja turvallisuuteen vaikuttavat tekijät
- Solutyyppi: primaarisolut ja erikoistuneet solut ovat usein vaikeammin transfektoitavissa kuin jatkuvat solulinjat.
- Nukleiinihapon laatu ja formaatti (plasmidi vs. mRNA vs. RNP).
- Määrä ja suhteet (DNA/RNA ja reagenssi).
- Kemiallinen tai fysikaalinen käsittely: olosuhteet optimoitava solulle sopiviksi, jotta toksisuus on vähäistä.
- Mahdolliset immuunireaktiot ja viruksen kontaminointiriski virusta käytettäessä.
Kontrollit ja validointi
On tärkeää käyttää sopivia negatiivisia ja positiivisia kontrollikokeita: esimerkiksi tyhjä vektori (mock), tunnettu tehokas raporttivektori (esim. GFP) ja toksisuuskontrollit. Tehokkuutta mitataan usein raporttigeenien avulla (fluoresenssi, luciferase) ja transgeenin ilmentymisen tarkastus tehdään RT-qPCR:llä tai länsi-blotilla. Pysyvässä selektiossa single-cell cloning ja genotyyppitestaus varmistavat integraation ja ilmentymisen.
Riskit ja eettiset näkökulmat
Transfektio voi muuttaa solun fysiologiaa, aiheuttaa off-target-efektejä tai induktoida soluvasteita kuten stressiä ja apoptosoitumista. Viruksia käytettäessä on huomioitava biosafety tasot ja mahdolliset biosuojatoimenpiteet. Geeniterapian ja geneettisen muokkauksen käytössä on myös eettisiä ja sääntelyyn liittyviä vaatimuksia, joita on noudatettava.
Yhteenveto
Transfektio on keskeinen työkalu molekyylibiologiassa ja biolääketieteessä, joka mahdollistaa geneettisen materiaalin kohdistetun tuonnin soluihin. Menetelmiä on useita, ja valinta riippuu käytettävästä solutyypistä, halutusta ilmentymän kestoajasta ja sovelluksesta. Huolellinen optimointi, kontrollit ja turvallisuus ovat onnistuneen ja eettisesti hyväksyttävän transfektion edellytyksiä.
DNA-konstruktiot
DNA-konstruktio on keinotekoisesti rakennettu nukleiinihapon osa, joka "siirretään" kohdekudokseen tai -soluun. Se voi sisältää DNA-insertin, joka sisältää kiinnostavaa proteiinia koodaavan geenisekvenssin.
DNA-insertti on molekyylibiologisen vektorin sydän. Tämä on yleisnimitys välineelle, jota käytetään vieraan geneettisen materiaalin siirtämiseen toiseen soluun. Eläinsolujen transfektioon kuuluu yleensä väliaikaisten huokosten (reikien) avaaminen solukalvoon, jotta solut voivat ottaa vektorin vastaan.
Kysymyksiä ja vastauksia
K: Mitä on transfektio?
V: Transfektio on prosessi, jossa DNA:ta tai RNA:ta tuodaan tarkoituksellisesti soluihin.
K: Miten termi "transfektio" muodostuu?
V: Termi "transfektio" muodostuu sanoista "transformaatio" ja "infektio".
K: Mitä eri transfektiotyyppejä on olemassa?
V: Erilaisia transfektiotyyppejä ovat muun muassa: bakteerisolujen muuntaminen virusnukleiinihapoilla, eläinsolujen muuntaminen kudosviljelmissä puhdistetulla DNA:lla, solujen tai alkioiden muuntaminen yksi- tai kaksisäikeisellä RNA:lla ja geeniterapia, jossa käytetään muunnettua virusta vektorina.
K: Mitä tapahtuu, kun DNA lisätään solujen genomiin transfektion aikana?
V: Kun DNA:ta lisätään solujen genomiin transfektion aikana, se voi aiheuttaa tiettyjen proteiinien rakentamisen tai tiettyjen geenien vaimentamisen.
K: Voivatko RNA-molekyyleillä transfektoimalla aikaansaadut muutokset siirtyä pysyvästi solulinjassa eteenpäin?
V: Ei, RNA-molekyyleillä tehdyllä transfektiolla aikaansaadut muutokset eivät voi siirtyä pysyvästi solulinjassa eteenpäin.
K: Mitä transfektio voi saada aikaan?
V: Transfektio voi johtaa odottamattomiin morfologioihin ja poikkeavuuksiin kohdesoluissa.
K: Mikä on geeniterapian tarkoitus käyttämällä muunnettua virusta vektorina?
V: Muunneltua virusta vektorina käyttävän geeniterapian tarkoituksena on lisätä uusia, toimivia geenejä geneettisestä sairaudesta kärsivän yksilön perimään, jotta sairaus voitaisiin korjata tai hoitaa.
Etsiä