Transformaatio (genetiikka): miten bakteerit ottavat ja ilmentävät DNA:ta
Transformaatio (genetiikka): Opas bakteerien DNA:n ottamiseen ja ilmentämiseen — luonnollinen ja keinotekoinen muuntuminen, pätevyys, konjugaatio ja transduktio.
Molekyylibiologiassa transformaatio on solun geneettinen muutos, joka tapahtuu ottamalla ja ilmentämällä DNA:ta suoraan solun ympäristöstä.
Muuntumista tapahtuu luonnostaan joissakin bakteerilajeissa, ja sitä voidaan tehdä myös keinotekoisesti. Bakteereja, jotka pystyvät muuntumaan joko luonnollisesti tai keinotekoisesti, kutsutaan päteviksi.
Transformaatio on yksi kolmesta prosessista, joilla ulkopuolinen geneettinen materiaali voidaan saada bakteerisoluihin. Kaksi muuta ovat konjugaatio (geneettisen materiaalin siirto kahden suoraan kosketuksissa olevan bakteerisolun välillä) ja transduktio (vieraan DNA:n ruiskuttaminen bakteerifaagin avulla isäntäsoluun).
Transformaatiota voidaan käyttää myös kuvaamaan uuden geneettisen materiaalin lisäämistä muihin kuin bakteerisoluihin, kuten eläin- ja kasvisoluihin. Vieraan DNA:n tuomista eukaryoottisoluihin kutsutaan yleensä "transfektioksi".
Luonnollinen kompetenssi ja mekanismi
Joillakin bakteereilla on kyky siirtää solukalvon läpi vapaata DNA:ta ympäristöstä ilman ulkoista käsittelyä. Tätä ominaisuutta kutsutaan luonnolliseksi kompetenssiksi. Kompetenssi on usein säätelymekanismi, joka aktivoituu tietyissä olosuhteissa, kuten ravinteiden puutteessa, stressissä tai tietyn tiheystason (quorum sensing) saavuttaessa.
Tavallinen luonnollisen transformaation vaihesarja on:
- DNA:n vapautuminen ympäristöön (esim. solujen lysi tai solun ulkopuoliset fragmentit),
- DNA:n tunnistus ja sitoutuminen solukalvon pinta- tai kompetenssi-proteiineihin,
- kuljetus solukalvon läpi (usein DNA:n yksijuosteiseksi pilkkominen ennen tai sisäänkuljetuksen aikana),
- sisäinen suojaus ja mahdollinen rekombinaatio kromosomaalisen DNA:n kanssa (tyypillisesti homologinen rekombinaatio käyttämällä proteiineja kuten RecA),
- vieraan DNA:n ilmentyminen ja sen aiheuttaman fenotyypin mahdollinen pysyvä muuttuminen.
Monet kompetenssiin liittyvät geenit koodaavat kalvoproteiineja, nukleaasit ja rekombinaatioproteiineja (esim. Com-proteiinit Streptococcus- ja Neisseria-lajeissa, competence-kompleksit Bacillusissa). Joissakin lajeissa DNA voi säilyä plasmidina, jolloin se replikoituu erillisenä geeniyksikkönä ja aiheuttaa uusia ominaisuuksia ilman kromosomaalista integrointia.
Keinotekoiset menetelmät
Laboratoriossa transformaatio voidaan toteuttaa monella tavalla, joilla kasvatetaan solujen kykyä ottaa ulkopuolista DNA:ta:
- Kemiallinen kompetentointi (esim. CaCl2): solut käsitellään ioneilla, jotka lisäävät solukalvon läpäisevyyttä, ja DNA:n jälkeen annetaan lämpöshokki (heat-shock) edistämään uptakea.
- Elektrorporaatio: lyhyet sähkökenttäpulssit avaavat solukalvoihin väliaikaisia poroja, jolloin DNA pääsee soluun; tehokas erityisesti suurille plasmideille ja monille bakteereille.
- Protoplastitransformaatio: soluseinä poistetaan, jolloin solunottokynnys pienenee; käytetään esimerkiksi grampositiivisilla bakteereilla ja joillain sienten ja kasvien solutyypeillä.
- PEG-välitteinen transformaatio (polyetyleeniglykoli): usein käytetty eukaryoottisolujen transformaatiossa protoplastien kanssa.
Sovellukset ja merkitys
Transformaatiolla on laaja merkitys sekä perustutkimuksessa että bioteknologiassa:
- Geenien klonaukseen, rekombinanttisen proteiinin tuottamiseen ja plasmiditutkimuksiin.
- Genomin muokkaus- ja ehdollinen ilmentäminen -menetelmiin yhdistettynä (esim. CRISPR/Cas-järjestelmät usein siirretään soluihin transformaatioilla).
- Rokote- ja lääkeaineiden kehitystyössä geenien toiminnan vaikutusten testaamiseen.
- Luonnollisten populaatioiden kannalta transformaatio on tärkeä mekanismi horizontaalisessa geeninsiirrossa, esimerkiksi antibioottiresistenssigeenien leviäminen voi tapahtua transformaation välityksellä.
Rajoitukset ja turvallisuus
Transformaation tuloksellisuuteen vaikuttavat monenlaiset tekijät: DNA:n koko ja muoto, solulaji, solujen kompetenssitila, rajoitus-modifikaatiojärjestelmät (bakteerien endonukleaasit voivat pilkkoa vierasta DNA:ta) sekä ympäristötekijät. Myös laboratoriokäytännöt ja biosafety-standardeja noudattaminen ovat tärkeitä, koska muuntuneiden organismien käsittely voi aiheuttaa ympäristö- ja terveysriskejä.
Esimerkkilajeja
Luonnollisesti kompetentteja bakteereja ovat muun muassa Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae ja Acinetobacter baumannii. Näiden lajien kompetenssi ja transformaatiomekanismit eroavat ja ovat aktiivisen tutkimuksen kohteena.
Yhteenvetona: transformaatio on keskeinen mekanismi, jolla bakteerit (ja keinotekoisesti myös muut solut) voivat hankkia ja ilmentää ulkopuolista DNA:ta. Se on sekä luonnollinen evoluution väline että voimakas työkalu biotieteissä, mutta siihen liittyy myös teknisiä ja eettisiä haasteita, jotka on otettava huomioon.
Historia
Muuntumisen osoitti ensimmäisen kerran vuonna 1928 brittiläinen bakteriologi Frederick Griffith. Griffith havaitsi, että harmittomasta Streptococcus pneumoniae -kannasta voitiin tehdä virulentti sen jälkeen, kun se oli altistettu lämpötappamiselle virulentille kannalle.
Griffith arveli, että jokin lämpötappokannasta peräisin oleva "muuntautumisperiaate" teki vaarattomasta kannasta virulentin. Vuonna 1944 Oswald Avery, Colin MacLeod ja Maclyn McCarty tunnistivat tämän muuntumisperiaatteen geneettiseksi. He eristivät DNA:ta S. pneumoniae -virulenttisesta kannasta ja pystyivät pelkästään tätä DNA:ta käyttämällä tekemään vaarattomasta kannasta virulentin. He kutsuivat tätä DNA:n ottamista ja sisällyttämistä bakteereihin "transformaatioksi". Katso Avery-MacLeod-McCartyn koe.
Tiedeyhteisö suhtautui aluksi epäilevästi näiden kokeiden tuloksiin. Averyn kokeet hyväksyttiin vasta, kun Joshua Lederberg löysi muita geneettisiä siirtomenetelmiä (konjugaatio vuonna 1947 ja transduktio vuonna 1953). Transformaatiosta tuli laboratorioiden rutiinimenetelmä vasta vuonna 1972, jolloin Cohen onnistui muuntamaan Escherichia coli -bakteerin käsittelemällä bakteeria kalsiumkloridilla. Tämä loi tehokkaan ja kätevän menettelyn bakteerien muuntamiseen ja avasi tien biotekniikalle ja tutkimukselle.
Myös eläin- ja kasvisolujen muuntamista tutkittiin, ja ensimmäinen siirtogeeninen hiiri luotiin ruiskuttamalla rotan kasvuhormonin geeni hiiren alkioon vuonna 1982.
Vuonna 1907 löydettiin kasvien kasvaimia aiheuttava Agrobacterium tumefaciens -bakteeri, ja 1970-luvun alussa todettiin, että kasvaimia aiheuttava tekijä oli Ti-plasmidiksi kutsuttu DNA-plasmidi. Poistamalla plasmidista ne geenit, jotka aiheuttivat kasvaimen, ja lisäämällä uusia geenejä tutkijat pystyivät tartuttamaan kasvit A. tumefaciensilla ja antamaan bakteerien lisätä valitsemaansa DNA:ta kasvien genomiin.
Kaikki kasvisolut eivät ole alttiita A. tumefaciens -bakteerin tartunnalle, joten on kehitetty muita menetelmiä, kuten elektroporaatio ja mikroinjektio. Hiukkaspommitus tuli mahdolliseksi, kun John Sanford keksi Biolistic Particle Delivery System -järjestelmän (geenitykki) vuonna 1990.
Kysymyksiä ja vastauksia
K: Mitä on transformaatio molekyylibiologiassa?
V: Transformaatio on solun geneettinen muutosprosessi, jossa solu ottaa ja ilmentää suoraan DNA:ta ympäristöstään.
K: Missä bakteerilajeissa transformaatiota tapahtuu luonnollisesti?
V: Transformaatiota tapahtuu luonnollisesti joissakin bakteerilajeissa.
K: Mitä termiä käytetään bakteereista, jotka pystyvät muuntumaan?
V: Bakteereja, jotka pystyvät muuntumaan, kutsutaan kompetenteiksi.
K: Mitkä ovat transformaation lisäksi kaksi muuta prosessia, joilla ulkopuolinen geneettinen materiaali voidaan tuoda bakteerisoluihin?
V: Kaksi muuta prosessia, joilla ulkopuolinen geneettinen materiaali voidaan tuoda bakteerisoluihin, ovat konjugaatio ja transduktio.
K: Voidaanko transformaatio tehdä keinotekoisesti?
V: Kyllä, transformaatio voidaan tehdä myös keinotekoisesti.
K: Mikä on transfektion määritelmä?
V: Transfektio on prosessi, jossa uutta geneettistä materiaalia tuodaan muihin kuin bakteerisoluihin, kuten eläin- ja kasvisoluihin.
K: Miten transduktio eroaa transformaatiosta?
V: Transduktioon liittyy vieraan DNA:n ruiskuttaminen bakteriofagin avulla isäntään, kun taas transformaatioon liittyy DNA:n suora ottaminen ja ilmentyminen ympäristöstä.
Etsiä