Suunnattu evoluutio
Suunnattu evoluutio (DE) on menetelmä, jota käytetään entsyymien tuottamiseen teollisiin tai lääketieteellisiin tarkoituksiin.
Menetelmänä on proteiinitekniikka, joka jäljittelee luonnonvalintaa.
Perusajatuksena on, että geenin mutaatioita toistetaan toistuvasti, jotta saadaan aikaan muunnoskirjasto. Valinta eristää geenit, joilla on haluttu tehtävä. Ne toimivat mallina seuraavaa kierrosta varten.
Tämä voidaan tehdä in vivo (elävissä bakteeri- tai hiivasoluissa) tai in vitro (vapaasti liuoksessa tai mikropisaroissa).
Useampien mutanttien testaaminen lisää mahdollisuuksia löytää sellainen mutantti, jolla on halutut ominaisuudet.
In vivo -evoluution aikana jokainen solu (yleensä bakteeri tai hiiva) transformoidaan plasmidilla, joka sisältää eri muunnoskirjaston jäsenen. Ainoastaan kiinnostava geeni eroaa solujen välillä, ja kaikki muut geenit pidetään samoina.
Solut ilmentävät proteiinia joko sytoplasmassaan tai pinnallaan, jolloin sen toimintaa voidaan testata. Tämän formaatin etuna on, että ominaisuudet voidaan valita soluympäristössä, mikä on hyödyllistä, kun kehitettyä proteiinia tai RNA:ta aiotaan käyttää elävissä organismeissa.
Kun DE tehdään ilman soluja, siinä käytetään in vitro transkriptiotranslaatiota proteiinien tai RNA:n tuottamiseksi vapaasti liuoksessa tai keinotekoisten mikropisaroiden sisällä. Tästä on se etu, että se mahdollistaa useammat olosuhteet (esim. lämpötila, liuottimet). Sillä voidaan ilmentää proteiineja, jotka olisivat myrkyllisiä soluille. Lisäksi in vitro -evoluutiokokeissa voidaan tuottaa paljon suurempia kirjastoja (jopa 1015), koska kirjaston DNA:ta ei tarvitse lisätä soluihin. Tämä rajoittaa usein sitä, mitä voidaan tehdä.
Esimerkki suunnatusta evoluutiosta ja vertailu luonnolliseen evoluutioon. Sisempi sykli esittää suunnatun evoluution syklin kolme vaihetta, ja suluissa on jäljitelty luonnollinen prosessi. Ulompi ympyrä osoittaa tyypillisen kokeen vaiheet. Punaiset symbolit kuvaavat toiminnallisia muunnoksia, vaaleat symbolit kuvaavat muunnoksia, joiden toiminta on vähentynyt.
Perinnöllisyyden varmistaminen
Kun toimivia proteiineja on eristetty, on välttämätöntä, että myös niiden geenit ovat toimivia, joten tarvitaan genotyypin ja fenotyypin välinen yhteys.
Tämä voi olla kovalenttista, jolloin mRNA-geeni on yhdistetty proteiiniin translaation lopussa puromysiinillä.
Vaihtoehtoisesti proteiini ja sen geeni voidaan pitää yhdessä tai emulsiopisaroissa. Eristetyt geenisekvenssit monistetaan sitten PCR:llä tai muunnetuilla isäntäbakteereilla. Joko yksittäistä parasta sekvenssiä tai sekvenssien joukkoa voidaan käyttää mallina seuraavalle mutageenikierrokselle. Toistuvat monipuolistaminen-valikoiminen-monistaminen -syklit tekevät entsyymimuunnoksista valintamenettelyyn sopeutuneita.
Ekspressoitu proteiini voidaan yhdistää kovalenttisesti geeniinsä (kuten mRNA:ssa) (vasemmalla) tai sijoittaa sen kanssa samaan lokeroon (oikealla). Kummallakin tavalla proteiinia koodaava geeni eristetään.
Myönnetty palkinto
Yhdysvaltalainen insinööri Frances Arnold on saanut Millennium-teknologiapalkinnon suunnatun evoluution uranuurtajana.
Kysymyksiä ja vastauksia
K: Mitä on suunnattu kehitys?
V: Suunnattu evoluutio (DE) on menetelmä, jota käytetään entsyymien tuottamiseen teollisiin tai lääketieteellisiin tarkoituksiin. Se on eräänlainen proteiinitekniikan muoto, joka jäljittelee luonnonvalintaa.
K: Miten ohjattu evoluutio toimii?
V: Suunnattu evoluutio toimii siten, että geeni altistetaan toistuville mutaatiokierroksille, jolloin syntyy muunnoskirjasto. Valinta eristää sitten geenit, joilla on haluttu funktio, ja niitä käytetään mallina seuraavalla kierroksella.
K: Missä suunnattua evoluutiota voidaan tehdä?
V: Suunnattua evoluutiota voidaan tehdä in vivo (elävissä bakteeri- tai hiivasoluissa) tai in vitro (vapaasti liuoksessa tai mikropisaroissa).
K: Mitä etuja on suunnatun evoluution tekemisessä in vivo?
V: Suuntautuneen evoluution tekeminen in vivo tarjoaa sen edun, että ominaisuudet voidaan valita soluympäristössä, mikä on hyödyllistä, kun kehitettyä proteiinia tai RNA:ta on tarkoitus käyttää elävissä organismeissa.
K: Mitä etuja on suunnatun evoluution tekemisessä in vitro?
V: Suuntautuneen evoluution tekeminen in vitro tarjoaa sen edun, että siinä voidaan käyttää useampia olosuhteita (esim. lämpötila, liuottimet) ja siinä voidaan ilmentää proteiineja, jotka olisivat myrkyllisiä soluille. Lisäksi voidaan luoda paljon suurempia kirjastoja, koska DNA:ta ei tarvitse lisätä soluihin.
K: Mikä rajoittaa sitä, mitä in vitro -kokeen aikana voidaan tehdä?
V: In vitro -kokeen kokorajoitus määräytyy usein sen mukaan, kuinka paljon DNA:ta on lisättävä soluihin.
