ELISA-testi (entsyymi-immunosorbentti) — määritelmä, periaate ja käyttö
ELISA-testi (entsyymi-immunosorbentti): selkeä opas periaatteisiin, käyttöön ja tulkintaan diagnostiikassa ja tutkimuksessa — kvantifioi antigeenit ja sytokiinit luotettavasti.
ELISA-menetelmä (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) on biokemiassa ja molekyylilääketieteessä laajasti käytetty immunologinen analyysitekniikka, jolla selvitetään, esiintyykö näytteessä tiettyä ainetta, esimerkiksi tiettyä sytokiinia tai antigeenia. Menetelmää kutsutaan joskus myös lyhenteellä EIA (Enzyme Immunoassay).
Periaate
ELISA perustuu vasta-aineiden ja antigeenien spesifiseen sitoutumiseen. Yleisesti käytetty periaate on seuraava:
- Testiastiaan (tyypillisesti polystyreeninen 96-kaukalo) kiinnitetään joko antigeeni tai capture-vasta-aine.
- Näyte (esim. seerumi, plasma, soluuten, kudoshomogenaatti) lisätään ja mahdollinen kohdeaine sitoutuu kiinnitettyyn komponenttiin.
- Vapaat pinnat estetään (blocking) proteiineilla kuten BSA:lla tai maitoproteiinilla, jotta ei-toivottu sitoutuminen vähenee.
- Lisätään toinen, entsyymiä kantava merkintävasta-aine (detection antibody), joka sitoutuu kohdeaineeseen.
- Lisätään entsyymin substraatti — entsyymi (esim. HRP eli horseradish peroxidase tai alkalinen fosfataasi) katalysoi substraatin muuntumisen värilliseksi tai valoa tuottavaksi tuotteeksi.
- Signaali mitataan spektrofotometrisesti (väri), luminometrisesti (kemiluminesenssi) tai fluorometrisesti ja määrällinen pitoisuus päätellään verrattuna standardikäyrään.
ELISA-tyypit
- Suora ELISA: Merkitynvasta-aine, joka on suoraan conjugoitunut entsyymiin, tunnistaa antigeenin. Nopeampi, mutta vähemmän herkullinen signaalin vahvistus.
- Indirekti ELISA: Kohdeantigeeni tunnistetaan ensisijaisella vasta-aineella ja toissijaisella entsyymiä kantavalla vasta-aineella. Antenninkerrosten vuoksi herkkyys yleensä parempi.
- Sandwich ELISA: Käytetään, kun halutaan tunnistaa suuri antigeni: yksi vasta-ainesarja sitoo antigeenin kiinni (capture) ja toinen, eri epitooppia tunnistava vasta-ainesarja toimii detektiivinä. Yleinen diagnostisissa testeissä ja kvantitatiivisissa määrityksissä.
- Competition (kilpaileva) ELISA: Näytteessä oleva antigeeni kilpailee merkityn antigeenin kanssa rajoitetusta vasta-ainetarjonnasta. Soveltuu pienikokoisille molekyyleille tai tilanteisiin, joissa sandwich-ELISA ei ole mahdollista.
Yleiset käytännön vaiheet ja reagenssit
- Pinnoitus (coating) capture-komponentilla; tyypillisessä pinnoituksessa käytetään yökestoista inkubointia tai lyhyempää lämpöinkubointia.
- Blocking (estihoito) vähentää ei-spesifistä taustasignaalia.
- Pesuvaiheet ovat kriittisiä: huolellinen pesu vähentää taustaa ja parantaa toistettavuutta.
- Yleisimmät entsyymimerkit: HRP (horseradish peroxidase) ja alkalinen fosfataasi. Tyypillisiä substraatteja ovat TMB, OPD (värit), pNPP (alk. fosfataasille) ja luminolipohjaiset reagenssit (kemiluminesenssi).
- Mittaus: väri mitataan optisella tiheydellä (esim. 450 nm TMB:n jälkeen stop-liuoksen lisäyksen jälkeen), kemiluminesenssi luetaan luminometrillä tai fluoresenssi fluorometrillä.
- Kvantifiointi perustuu standardikäyrään, jossa tunnetut pitoisuudet tuottavat signaalin ja näytteen signaali sijoitetaan tälle käyrälle.
Sovellukset
ELISA on erittäin laajalti käytetty. Tyypillisiä käyttökohteita:
- Diagnostiikka: tartuntatautien (esim. HIV, hepatitit), autoimmuunisairauksien ja allergioiden testeissä.
- Tutkimus: sytokiinien, kasvutekijöiden, proteiinien ja muiden biomarkkereiden määritys solu- ja eläinmalleissa.
- Elintarvike- ja ympäristötestaus: allergeenien, toksiinien tai hormonien seulonta.
- Lääke- ja rokotetutkimukset: immunoresponssien ja spesifisten vasta-ainetasojen seuranta.
Edut ja rajoitukset
- Edut: suhteellisen helppo, skaalautuva (korkean läpimenon 96/384-kaukalo), usein kustannustehokas, mahdollistaa sekä kvalitatiivisen että kvantitatiivisen mittauksen.
- Rajoitukset: esiintyvä taustasignaali ja epäspecificiteetti voivat johtaa väärin tulkittuihin tuloksiin; herkkyys ja spesifisyys riippuvat käytetyistä vasta-aineista. Myös ns. hook-efekti (suuri määrä analyyttiä aiheuttaa väärin matalan signaalin saturaatiossa) voi antaa virheellisen tuloksen korkeissa pitoisuuksissa.
- Tarvitaan kunnolliset positiiviset ja negatiiviset kontrollit sekä standardit varmistaamaan testin luotettavuus.
Laadunvarmistus ja tulkinta
Luotettavaan ELISA-tulokseen kuuluu validit standardikäyrät, toistettavuustarkastukset (intra- ja inter-assay CV), sopivat kontrollit ja selkeät rajaarvot. Mahdolliset interferenssit (esim. vasta-aineet näytteessä, hemolyysi, lipidit, lääkkeet) on huomioitava. Epäselvissä tapauksissa tulokset voidaan vahvistaa vaihtoehtoisilla menetelmillä, kuten Western blotilla tai PCR-pohjaisilla testeillä riippuen analyytistä.
Tekniset kehitykset
ELISAa on kehitetty monin tavoin: automatisoidut laitteet, mikrofluidiset järjestelmät, kemiluminesenssi- ja fluoresenssipohjaiset modifikaatiot parantavat herkkyyttä ja laajentavat sovelluksia. ELISA:sta on kehittynyt myös solutason mittauksiin suunnattu ELISPOT-menetelmä, joka on erittäin herkkä ja mahdollistaa yksittäisten solujen erittelemien molekyylien paikannuksen ja laskennan.
Käytännön vinkkejä
- Säilytä vasta-aineet ja reagenssit valmistajan ohjeiden mukaan — entsyymit ja substraatit ovat herkkiä lämpötilalle ja valolle.
- Optimoi pesu- ja inkubointiaika sekä blocking-olosuhteet vähentääksesi taustaa.
- Laadi ja seuraa standardikäyrää jokaisella koejärjestelyllä.
- Huomioi näytteen käsittely: toistuvasta jäädytys-sulatus-kierrosta kannattaa välttää ja tarvittaessa suorittaa näytepuhtaus- tai diluutio-optimointeja.
ELISA on vakiintunut ja monipuolinen menetelmä, jolla voidaan luotettavasti mitata proteiineja ja muita molekyylejä monenlaisista näytteistä, kunhan testin suunnittelu, validointi ja kontrollit ovat kunnossa.
Kysymyksiä ja vastauksia
Q: Mikä on ELISA?
V: ELISA on lyhenne sanoista Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay, joka on biokemiassa käytetty tekniikka, jolla voidaan havaita tietyn aineen läsnäolo näytteessä.
K: Miten ELISA toimii?
V: ELISA-menetelmässä käytetään vasta-aineita, jotka kiinnittyvät testattavaan aineeseen ja tuottavat tietyn värin, joka ilmaisee läsnä olevan aineen määrän.
K: Millaisia aineita ELISA-testillä voidaan havaita?
V: ELISA-menetelmällä voidaan havaita näytteessä olevat tietyt sytokiinit tai antigeenit.
K: Mitä ELISA:n tuottaman värin määrä osoittaa?
V: ELISA-testissä syntyvän värin määrä osoittaa näytteessä olevan testattavan aineen määrän.
K: Onko ELISA ainoa tekniikka, jota käytetään tiettyjen aineiden osoittamiseen näytteestä?
V: Ei, on olemassa kehittyneempi ja herkempi tekniikka, ELISPOT-menetelmä, joka on johdettu ELISA-tekniikasta.
K: Mikä on ELISA-menetelmässä käytettävän toisen vasta-ainesarjan tehtävä?
V: ELISA-menetelmässä toista vasta-ainesarjaa käytetään vangitsemaan testattava aine, ja se tarttuu sekä aineeseen että testisäiliöön pitääkseen aineen paikallaan.
K: Tuottaako ELISA-testi aina väriä, kun aine havaitaan?
V: Ei aina, joskus ainetta on tarkasteltava ultraviolettivalossa, jotta vasta-aineet tuottavat värin.
Etsiä