Ohutkerroskromatografia (TLC) selitetty — periaate, käyttö ja sovellukset

Ohutkerroskromatografia (TLC) — selkeä opas periaatteisiin, käytännön suorittamiseen ja monipuolisiin sovelluksiin kemian ja laboratorioanalyysien tueksi.

Ohutkerroskromatografia (tai TLC) on menetelmä, jolla seokset erotetaan niiden yksittäisiin komponentteihin.

TLC suoritetaan TLC-levyllä. Nämä levyt koostuvat piidioksidikerroksesta, ja niiden takana on yleensä ohut lasipala, mutta myös muita materiaaleja, kuten muovia, voidaan käyttää. TLC-levyn etupuolella olevaa piidioksidipinnoitetta kutsutaan pysyväksi faasiksi.

Periaate ja erotusmekanismi

Ohutkerroskromatografian perusidea on, että näytekohdat kulkeutuvat pystysuunnassa kapillaarivoimien ja liuottimen haihtumisen vaikutuksesta liikkuvaa faasia (mobile phase) pitkin, ja eri yhdisteet liikkuvat eri nopeuksilla riippuen niiden affiniteetista pysyvään faasiin. Erotus perustuu yleensä adsorptioon (esim. piidioksidi, alumiinioksidi) tai partition-tyyppiseen jakautumiseen (esim. selluloosapohjaisissa levyissä).

Tarvittavat välineet ja materiaalit

• TLC-levy: päällystetty lasi-, muovi- tai alumiinipohja (esim. silica gel, alumina, cellulose). Joissain levyissä on UV-indikaattori (F254) valaisun helpottamiseksi.
• Kehityskammio: suljettava astia, jossa liuotin voi haihtua ja tasapainottua ennen levyn kehitystä (usein lautasella tai pesuvateilla tai paperisuikaleilla paraatissaturaation edistämiseksi).
• Näytteenottovälineet: kapillaarit, micro-syringet tai pienet pipetit pisteiden asettamiseen.
• Liukenevat liuottimet: kehitysliuokset (esim. heksaani/etikkahappi, kloroformi/metanoli) valitaan näytteen polariteetin mukaan.
• Visualisointivälineet: UV-lamppu (254/365 nm), värireagenssit kuten joodi, ninhydriini, KMnO4, anisaldehyde, Dragendorff ym.

Käytännön työvaiheet

• Merkitse TLC-levyn alaosaan lähtöviiva kevyesti lyijykynällä.
• Lisää hyvin pieni määrä näytettä pisteenä lähtöviivalle (käytä pieniä kapillaareja; pisteen tulee olla mahdollisimman pieni ja tiivis).
• Kuivaa pisteet nopeasti tarvittaessa lämmittämällä tai ilmakuivaamalla.
• Valmistele kehityskammio: kaada pohjalle sopiva määrä kehitysliuosta ja tarvittaessa aseta kostutettua filteripaperia seinälle tasapainottamaan höyryjä.
• Aseta levy pystyasentoon kehityskammioon siten, että lähtöviiva on liuoksen yläpuolella ilman että pisteet koskettavat liuosta.
• Anna liuotinfrontin nousta levyllä halutun etäisyyden (yleensä 3/4 levyn korkeudesta), ota levy pois ja merkitse välittömästi liuotinfrontin paikka lyijykynällä.
• Kuivaa levy ja visualisoi komponentit UV-valossa tai värireagensseilla.

Rf-arvo ja sen tulkinta

Rf-arvo (retentiofaktori) kertoo kuinka pitkälle yhdiste eteni suhteessa liuotinfronttiin:

Rf = (etäisyys lähtöviivasta yhdisteen keskelle) / (etäisyys lähtöviivasta liuotinfronttiin)

Rf-arvot ovat ominaisia käytetylle levylle, liuottimelle ja olosuhteille — muuttuvat olosuhteiden muuttuessa. Yleisesti: polarinen pysyvä faasi (kuten silica) pitää polaarisia yhdisteitä vahvemmin -> polaariset yhdisteet kulkevat hitaammin (pieni Rf) erityisesti ei-polarissa liuottimessa.

Visualisointi ja tunnistus

• UV: monet orgaaniset yhdisteet näkyvät UV-valossa, ja F254-levyt antavat tummia pisteitä fluoresoivalla taustalla.
• Värireagenssit: käytetään yhdisteisiin spesifisiä reagensseja — ninhydriini (aminaatit ja aminohapot), jodi (yleinen, ei-kestoa), KMnO4 (entsyymejä ja epätyydyttymättömiä yhdisteitä vastaan), anisaldehyde (eri värireaktioita useille ryhmille).
• Suora visualisointi: värejä omaavat yhdisteet voidaan nähdä paljaalla silmällä.

Sovellukset

• Näytteiden nopea todentaminen ja seoksen kvalitatiivinen analyysi kemian laboratorioissa.
• Reaktion seuranta orgaanisessa synteesissä — onko lähtöaine kulunut ja onko haluttu tuote muodostunut.
• Puhtauden arviointi ja erotusmenetelmien optimointi (liuottimien valinta ennen HPLC:tä).
• Luokittelu ja tunnistus esimerkiksi farmaseuttisissa, elintarvike- ja ympäristönäytteissä sekä oikeuslääketieteessä.
• Preparatiivinen TLC: paksummat levyt suuremmille näytemäärille yhdisteiden eristämiseksi ja talteenottamiseksi.

Edut ja rajoitukset

• Edut: nopea, edullinen, vaatii vähän näytettä, helppo oppia ja sopii nopeasti menetelmäoptimointiin.
• Rajoitukset: yleensä kvalitatiivinen tai vain puolikvantitatiivinen; huonompi resoluutio verrattuna HPLC:hen; tulokset riippuvat vahvasti olosuhteista (liuotin, lämpötila, kosteus, levyn laatu).

Vinkkejä ja hyvän käytännön ohjeita

• Käytä mahdollisimman pieniä ja tiheitä näytepisteitä; liian suuret pisteet hämärttävät erotuksen.
• Merkitse lähtöviiva ja liuotinfront välittömästi; käytä lyijykynää, joka ei liukene liuottimiin.
• Valitse liuotinjärjestelmä systemaattisesti: testaa eri seoksia ja aloita yleisistä järjestelmistä (esim. heksaani/etikka 9:1 -> 7:3 -> 1:1; kloroformi/metanoli jne.).
• Standardit ja rinnakkaisajot helpottavat yhdisteiden tunnistusta ja Rf-arvojen vertailua.
• Pidä kehityskammio hyvin suljettuna ja tarvittaessa esikostuta (saturation) jotta kehitys on toistettavampaa.

Turvallisuus

Monet kehityssolventit ovat helposti syttyviä ja toksisia — käytä työskentelyssä hyvin ilmastoituja tiloja tai fume hoodia ja asianmukaisia suojavarusteita (käsineet, suojalasit). Jätteiden hävittäminen tulee tehdä paikallisten määräysten mukaisesti.

Yhteenveto

Ohutkerroskromatografia on monipuolinen ja helposti toteutettava analyysimenetelmä, joka on erinomainen työkalu nopeaan näytteiden seurantaan, menetelmän optimointiin ja pienimuotoiseen erotteluun. Menestyksellinen TLC-vaatii huolellisen valmistelun: oikean levyn, sopivan liuotinjärjestelmän ja huolellisen näytteen asettelun.

Hae kirjaimella