Termodesorptio-kaasukromatografi-massaspektrometri

Historia

Ensimmäiset kaasunestekromatografiaa koskevat tutkimusjulkaisut julkaistiin vuonna 1950. Kemistit käyttivät erilaisia ilmaisimia havaitakseen, että kromatografin päädystä virtasi ulos yhdisteitä. Useimmat detektorit tuhosivat yhdisteet, koska ne polttivat ne tai ionisoivat ne. Näiden detektoreiden vuoksi kemistit joutuivat arvaamaan kunkin näytteessä olevan yhdisteen tarkan identiteetin. 1950-luvulla Roland Gohlke ja Fred McLafferty kehittivät uuden yhdistelmäkoneen. He käyttivät massaspektrometriä kaasukromatografian ilmaisimena. Nämä varhaiset laitteet olivat isoja ja hauraita, ja alun perin ne rajoittuivat laboratorioympäristöihin.

Suunnittelu oli monimutkaista. Kromatografista ulos virtaavien eri yhdisteiden välistä aikaväliä oli vaikea hallita. Massaspektrometrin oli siis käsiteltävä yksi yhdiste loppuun ennen kuin seuraava yhdiste virtasi kromatografista ulos. Varhaisissa malleissa massaspektrometrin mittaukset kirjattiin kuvaajapaperille. Korkeasti koulutetut kemistit tutkivat piikkikuvioita kunkin yhdisteen tunnistamiseksi. 1970-luvulla massaspektrometreihin lisättiin analogi-digitaalimuunnin. Tämä mahdollisti sen, että tietokoneet pystyivät tallentamaan ja tulkitsemaan tuloksia. Tietokoneiden nopeutuessa ja pienentyessä GC-MS nopeutui ja levisi laboratorioista jokapäiväiseen elämään. Nykyään tietokoneistettuja GC-MS-laitteita käytetään laajalti veden, ilman ja maaperän ympäristöseurannassa. Sitä käytetään myös maatalouden sääntelyssä, elintarviketurvallisuudessa sekä lääkkeiden löytämisessä ja valmistuksessa.

Pienten tietokoneiden kehittyminen on auttanut GC-MS-laitteiden yksinkertaistamisessa. Se on myös vähentänyt huomattavasti näytteen analysointiin kuluvaa aikaa. Electronic Associates, Inc. (EAI) oli johtava yhdysvaltalainen analogisten tietokoneiden toimittaja. Vuonna 1964 EAI aloitti tietokoneohjatun massaspektrometrin kehittämisen Robert E. Finniganin johdolla. Vuoteen 1966 mennessä oli myyty yli 500 kaasuanalysaattoria. Vuonna 1967 perustettiin Finnigan Instrument Corporation (FIC). Vuoden 1968 alussa se toimitti ensimmäiset prototyypit nelipuolaisista GC-MS-laitteista Stanfordin ja Purduen yliopistoille. FIC:n nimi muutettiin lopulta Finnigan Corporationiksi, ja se vakiinnutti asemansa GC-MS-järjestelmien maailmanlaajuisena markkinajohtajana.

Perustoiminto

GC-MS:llä voidaan löytää kaikki näytekappaleeseen sekoittuneet yhdisteet. Käyttäjä liuottaa näytteen nesteeseen. Tämän jälkeen käyttäjä ruiskuttaa nesteen kaasuvirtaan. (Useimmiten käytetään helium-, vety- tai typpikaasua.) Kaasu virtaa putken läpi, jossa on erityinen pinnoite. Koska kukin näytteen yhdiste tarttuu pinnoitteeseen eri tavalla, kukin yhdiste poistuu putkesta eri aikaan. Pinnoitetta käytetään siis erottamaan kukin näytteessä sekoittunut yhdiste toisistaan. Kun kukin yhdiste tulee ulos putken päässä, se ionisoituu ja saa sähkövarauksen. Useimmat yhdisteet hajoavat, kun ne ionisoituvat. Eri kappaleet lentävät magneetin alle, joka erottaa kappaleet toisistaan niiden painon ja varauksen perusteella. Tämän jälkeen tietokone mittaa kunkin yhdisteen kaikki kappaleet. Vertaamalla mittaustuloksia tunnettujen yhdisteiden tietokonekirjastoon tietokone laatii luettelon kaikkien näytteessä olevien yhdisteiden nimistä. Tietokone voi myös kertoa, kuinka paljon kutakin yhdistettä oli näytteessä.

Instrumentointi

GC-MS koostuu kahdesta tärkeimmästä rakenneosasta: kaasukromatografista ja massaspektrometristä. Kaasukromatografi käyttää kapillaarikolonnia, joka riippuu kolonnin mitoista (pituus, halkaisija, kalvon paksuus) sekä faasin ominaisuuksista (esim. 5 % fenyylipolysiloksaani). Seoksen eri molekyylien välisten kemiallisten ominaisuuksien erot erottavat molekyylit toisistaan näytteen kulkiessa kolonnin pituutta pitkin. Molekyyleiltä kuluu erilainen aika (retentioaika) poistua (eluoitua) kaasukromatografista. Tämän ansiosta virtaussuunnassa seuraava massaspektrometri voi vangita, ionisoida, kiihdyttää, poikkeuttaa ja havaita ionisoituneet molekyylit erikseen. Massaspektrometri tekee tämän hajottamalla jokaisen molekyylin ionisoituihin fragmentteihin ja havaitsemalla nämä fragmentit niiden massan ja varauksen suhteen avulla.

Näitä kahta laitetta yhdessä käytettäessä aineiden tunnistaminen on paljon tarkempaa kuin kumpaakin laitetta erikseen käytettäessä. Tietyn molekyylin tarkka tunnistaminen ei ole mahdollista pelkästään kaasukromatografian tai massaspektrometrian avulla. Massaspektrometriamenetelmä edellyttää yleensä hyvin puhdasta näytettä. Aiemmin kaasukromatografiassa käytettiin muita ilmaisimia, kuten liekki-ionisaatiodetektoria. Näillä ilmaisimilla ei voida erottaa toisistaan eri molekyylejä, joiden matka kolonnin läpi kestää yhtä kauan. (Kun kahdella eri molekyylillä on sama retentioaika, niiden sanotaan "liukenevan yhdessä"). Yhteiselektoivat molekyylit sekoittavat tietokoneohjelmat, jotka lukevat molempien molekyylien yhden massaspektrin.

Joskus kahdella eri molekyylillä voi myös olla samanlainen ionisoituneiden fragmenttien kuvio massaspektrometrissä (massaspektri). Näiden kahden prosessin yhdistäminen vähentää virheen mahdollisuutta. On erittäin epätodennäköistä, että kaksi eri molekyyliä käyttäytyy samalla tavalla sekä kaasukromatografissa että massaspektrometrissä. Jos siis massaspektri vastaa kiinnostavaa analyyttiä, spektrin retentioaikaa voidaan verrata GC:n tyypilliseen retentioaikaan, mikä lisää varmuutta siitä, että analyytti on näytteessä.

Massaspektrometrin ilmaisintyypit

Yleisin GC:hen liitetty MS-tyyppi on nelipolinen massaspektrometri. Hewlett-Packard (nykyisin Agilent) markkinoi sitä kauppanimellä "Mass Selective Detector" (MSD). Toinen suhteellisen yleinen detektori on ioniloukku-massaspektrometri. Lisäksi voidaan käyttää magneettisektorin massaspektrometriä. Nämä laitteet ovat kuitenkin kalliita ja tilaa vieviä, eikä niitä tyypillisesti löydy korkean läpimenon palvelulaboratorioista. Käytössä on myös muita detektoreja, kuten lentoaikadetektoreita (TOF), tandemkvadrupoleja (MS-MS) (ks. jäljempänä) tai ioniloukku-MS:ääⁿ. N tarkoittaa massaspektrometrivaiheiden lukumäärää.

GC-MS:n sisäpuoli, oikealla kaasukromatografin kolonni uunissa.


GC-MS-kaavio

Analyysi

Massaspektrometriä käytetään yleensä kahdella tavalla: Full Scan tai Selective Ion Monitoring (SIM). Tyypillinen GC-MS voi toimia joko yksin tai molemmilla tavoilla samanaikaisesti.

Täydellinen skannaus MS

Kun tietoja kerätään täydessä skannaustilassa, massafragmenttien kohdealue valitaan ja asetetaan laitteen menetelmään. Esimerkki tyypillisestä laajasta seurattavasta massafragmenttien alueesta olisi m/z 50 - m/z 400. Käytettävän alueen määrittäminen määräytyy suurelta osin sen mukaan, mitä näytteessä odotetaan olevan, ja samalla on otettava huomioon liuotin ja muut mahdolliset häiriötekijät. Jos MS-järjestelmässä etsitään massafragmentteja, joiden m/z-arvo on hyvin alhainen, se saattaa havaita ilmaa tai muita mahdollisia häiriötekijöitä. Suuren skannausalueen käyttö vähentää laitteen herkkyyttä. Laite tekee vähemmän skannauksia sekunnissa, koska jokainen skannaus vie enemmän aikaa laajemman massafragmenttialueen havaitsemiseen.

Täydellinen skannaus on hyödyllinen määritettäessä näytteessä olevia tuntemattomia yhdisteitä. Se tarjoaa enemmän tietoa kuin SIM, kun on kyse näytteessä olevien yhdisteiden vahvistamisesta tai erottamisesta. Useimpia instrumentteja ohjataan tietokoneella, joka käyttää tietokoneohjelmaa, jota kutsutaan "instrumenttimenetelmäksi". Instrumenttimenetelmä ohjaa GC:n lämpötilaa, MS-skannauksen nopeutta ja havaittavien fragmenttikokojen vaihteluväliä. Kun kemisti kehittää instrumenttimenetelmää, hän lähettää testiliuokset GS-MS:n läpi täydessä skannaustilassa. Näin tarkistetaan GC:n retentioaika ja massafragmenttien sormenjälki ennen siirtymistä SIM-menetelmään. Erikoistuneisiin GC-MS-laitteisiin, kuten räjähdysaineilmaisimiin, on tehtaalla valmiiksi ladattu instrumenttimenetelmä.

Valittujen ionien seuranta

SIM-menetelmässä (selected ion monitoring) laite keskittyy tiettyihin ionifragmentteihin. Massaspektrometri havaitsee vain nämä massafragmentit. SIM-menetelmän etuna on, että havaitsemisraja on alhaisempi, koska laite tarkastelee vain pientä määrää fragmentteja (esim. kolmea fragmenttia) jokaisen skannauksen aikana. Skannauksia voidaan tehdä useampia sekunnissa. Koska vain muutamaa kiinnostavaa massafragmenttia seurataan, matriisihäiriöt ovat yleensä vähäisempiä. Positiivisen tuloksen oikean lukemisen todennäköisyyden parantamiseksi eri massafragmenttien ionisuhteet ovat vertailukelpoisia tunnetun vertailustandardin kanssa.

Ionisaatiotyypit

Kun molekyylit ovat kulkeneet kolonnin pituuden, kulkeneet siirtolinjan läpi ja tulleet massaspektrometriin, ne ionisoidaan eri menetelmillä. Tyypillisesti käytetään aina vain yhtä ionisointimenetelmää. Kun näyte on pirstoutunut, se havaitaan yleensä elektronikerroindiodin avulla. Diodi käsittelee ionisoitunutta massafragmenttia kuin sähköistä signaalia, joka sitten havaitaan.

Kemistit valitsevat ionisointitekniikan erikseen Full Scan- tai SIM-seurannan valinnasta.

Elektroni-ionisaatio

Yleisin ionisaatiotyyppi on elektroni-ionisaatio (EI). Molekyylit menevät MS:ään (lähteenä on kvadrupoli tai itse ioniloukku ioniloukku-MS:ssä), jossa niihin osuu vapaita elektroneja, jotka emittoituvat hehkulangasta. Tämä on samanlainen kuin tavallisessa hehkulampussa oleva hehkulanka. Elektronit osuvat molekyyleihin, jolloin molekyyli pirstoutuu tyypillisellä tavalla, joka voidaan toistaa. Tämä "kova ionisointitekniikka" johtaa siihen, että syntyy enemmän fragmentteja, joiden massa-varaus-suhde (m/z) on alhainen. EI:ssä syntyy vain vähän tai ei lainkaan fragmentteja, joiden massa on lähellä alkuperäisen molekyylin massaa. Kemistit pitävät kovaa ionisointia elektronien ampumisena näytemolekyyleihin. Pehmeä ionisaatio sen sijaan tarkoittaa varauksen asettamista näytemolekyylille osumalla siihen johdetulla kaasulla. Molekyylin pirstoutumismalli riippuu järjestelmään käytetystä elektronienergiasta, joka on tyypillisesti 70 eV (elektronivolttia). 70 eV:n käyttö auttaa vertaamaan testinäytteestä tuotettuja spektrejä tunnettuihin kirjastospektreihin. (Kirjastospektrit voivat olla peräisin valmistajan toimittamasta ohjelmistosta tai National Institute of Standardsin (NIST-USA) kehittämästä ohjelmistosta). Ohjelmisto hakee kirjaston spektrejä käyttämällä vastaavuusalgoritmia, kuten Probability Based Matching tai dot-product matching. Monet menetelmien standardointielimet valvovat nykyään näitä algoritmeja ja menetelmiä niiden objektiivisuuden varmistamiseksi.

Kemiallinen ionisaatio

Kemiallisessa ionisaatiossa (CI) massaspektrometriin johdetaan reagenssikaasua, tyypillisesti metaania tai ammoniakkia. CI:tä on kahta tyyppiä: positiivinen CI tai negatiivinen CI. Kummassakin tapauksessa reagenssikaasu on vuorovaikutuksessa elektronien ja analyytin kanssa ja aiheuttaa kiinnostavan molekyylin "pehmeän" ionisaation. Pehmeämpi ionisaatio pirstoo molekyylin vähemmän kuin EI:n kova ionisaatio. Kemistit suosivat CI:tä EI:n sijaan. Tämä johtuu siitä, että CI tuottaa ainakin yhden massafragmentin, jonka paino on lähes sama kuin kiinnostavan analyytin molekyylipaino.

Positiivinen kemiallinen ionisaatio

Positiivisessa kemiallisessa ionisaatiossa (PCI) reagenssikaasu on vuorovaikutuksessa kohdemolekyylin kanssa, useimmiten protoninvaihdon avulla. Tämä tuottaa ionilajeja suhteellisen suuria määriä.

Negatiivinen kemiallinen ionisaatio

Negatiivisessa kemiallisessa ionisaatiossa (NCI) reagenssikaasu vähentää vapaiden elektronien vaikutusta kohdeanalyyttiin. Tämä vähentynyt energia jättää tyypillisesti fragmentin suureen määrään. (Fragmentit eivät hajoa enempää).

Tulkinta

Instrumenttianalyysin ensisijainen tavoite on mitata aineen määrä. Tämä tapahtuu vertaamalla atomimassojen suhteellisia pitoisuuksia tuotetussa massaspektrissä. Analyysejä on mahdollista tehdä kahta eri tyyppiä, vertailevaa ja alkuperäistä analyysiä. Vertailevassa analyysissä verrataan annettua spektriä spektrikirjastoon, jotta nähdään, esiintyykö sen ominaisuuksia jossakin kirjastossa olevassa tunnetussa näytteessä. Tämä on parasta suorittaa tietokoneella, koska mittakaavan vaihteluista johtuvia visuaalisia vääristymiä voi esiintyä paljon. Tietokoneet voivat myös korreloida enemmän tietoja (kuten GC:n tunnistamat retentioajat), jotta tietyt tiedot voidaan suhteuttaa tarkemmin toisiinsa.

Toinen analyysimenetelmä mittaa piikkejä suhteessa toisiinsa. Tässä menetelmässä korkein huippu asetetaan 100 prosenttiin. Muille piikeille annetaan arvo, joka vastaa piikin korkeuden ja korkeimman piikin korkeuden suhdetta. Kaikille yli 3 %:n arvoille annetaan arvo. Tuntemattoman yhdisteen kokonaismassa ilmoitetaan tavallisesti emopiikin avulla. Tämän emopiikin arvoa voidaan käyttää sovittamaan kemialliseen kaavaan, joka sisältää eri alkuaineet, joiden uskotaan sisältyvän yhdisteeseen. Isotooppikuvio spektrissä on ainutlaatuinen alkuaineille, joilla on useita isotooppeja. Sitä voidaan siis käyttää myös eri alkuaineiden tunnistamiseen. Tämä kertoo tuntemattoman molekyylin yleisen kemiallisen kaavan. Koska molekyylin rakenne ja sidokset hajoavat tyypillisillä tavoilla, ne voidaan tunnistaa piikkien massojen eroista. Tunnistetun molekyylin rakenteen on oltava yhdenmukainen GC-MS:n tallentamien ominaisuuksien kanssa. Tyypillisesti tämä tunnistus tehdään automaattisesti laitteen mukana toimitetuilla tietokoneohjelmilla. Nämä ohjelmat vertaavat spektrejä tunnettujen yhdisteiden kirjastoon, jossa on sama luettelo näytteessä mahdollisesti esiintyvistä alkuaineista.

Täyden spektrin analyysissä otetaan huomioon kaikki spektrin "huiput". Selektiivisessä ionimonitoroinnissa (SIM) seurataan kuitenkin vain tiettyyn aineeseen liittyviä valittuja piikkejä. Kemistit olettavat, että tietyllä retentioajalla joukko ioneja on tyypillinen tietylle yhdisteelle. SIM on nopea ja tehokas analyysi. SIM toimii parhaiten silloin, kun analyytikolla on aiempaa tietoa näytteestä tai hän etsii vain muutamia tiettyjä aineita. Kun tietyn kaasukromatografisen piikin ioneista kerättyjen tietojen määrä vähenee, analyysin herkkyys kasvaa. SIM-analyysin avulla voidaan siis havaita ja mitata pienempi määrä yhdistettä. Mutta varmuus kyseisen yhdisteen identiteetistä vähenee.

GC-tandem-MS

Kun lisätään toinen vaihe massan pirstoutumiselle, esimerkiksi käyttämällä toista kvadrupolia kvadrupoli-instrumentissa, sitä kutsutaan tandem-MS:ksi (MS/MS). MS/MS-menetelmällä voidaan mitata hyvin pieniä kohdeyhdisteiden pitoisuuksia näytteestä, jonka matriisissa on taustayhdisteitä, jotka eivät ole kiinnostavia.

Ensimmäinen kvadrupoli (Q1) on yhdistetty törmäyskennoon (q2) ja toiseen kvadrupoliin (Q3). Molempia kvadrupoleja voidaan käyttää skannaavassa tai staattisessa tilassa riippuen käytetystä MS/MS-analyysityypistä. Analyysityyppejä ovat tuoteionien skannaus, prekursori-ionien skannaus, Selected Reaction Monitoring (SRM) ja Neutral Loss Scan. Esim: Kun Q1 on staattisessa tilassa (tarkastellaan vain yhtä massaa kuten SIM:ssä) ja Q3 on skannaustilassa, saadaan niin sanottu tuoteionispektri (jota kutsutaan myös "tytärspektriksi"). Tästä spektristä voidaan valita näkyvä tuoteioni, joka voi olla valitun prekursori-ionin tuoteioni. Tätä paria kutsutaan "siirtymäksi", ja se muodostaa perustan SRM:lle. SRM on erittäin spesifinen ja poistaa matriisitaustan lähes kokonaan.

Sovellukset

Ympäristön seuranta ja puhdistaminen

Monet kemistit uskovat, että GC-MS on paras väline orgaanisten epäpuhtauksien seurantaan ympäristössä. GC-MS-laitteiden kustannukset ovat laskeneet paljon. GC-MS:n luotettavuus on samalla lisääntynyt. Molemmat parannukset ovat lisänneet käyttöä ympäristötutkimuksissa. Joitakin yhdisteitä, kuten tiettyjä torjunta-aineita ja rikkakasvien torjunta-aineita, ei voida tunnistaa GS-MS:llä. Ne ovat liian samankaltaisia muiden samankaltaisten yhdisteiden kanssa. GC-MS on kuitenkin erittäin herkkä ja tehokas useimpien ympäristönäytteiden, kuten monien tärkeimpien torjunta-aineluokkien, orgaanisten aineiden analysoinnissa.

Rikostekninen rikostekniikka

GC-MS:llä voidaan analysoida ihmiskehon hiukkasia, jotta rikollinen voidaan yhdistää rikokseen. Laki hyväksyy GC-MS:n käytön tulipalon jäänteiden analysointiin. Itse asiassa American Society for Testing Materials (ASTM) on laatinut standardin palojätteiden analysointia varten. GCMS/MS on erityisen hyödyllinen tässä yhteydessä, koska näytteet sisältävät usein hyvin monimutkaisia matriiseja, ja oikeudessa käytettävien tulosten on oltava erittäin tarkkoja.

Lainvalvonta

GC-MS:ää käytetään laittomien huumausaineiden havaitsemiseen, ja se saattaa lopulta korvata huumekoirat. Sitä käytetään yleisesti myös oikeuslääketieteellisessä toksikologiassa. Sen avulla voidaan löytää huumeita ja/tai myrkkyjä biologisista näytteistä, jotka on otettu epäillyistä, uhreista tai ruumiista.

Turvallisuus

Syyskuun 11. päivän 2001 terrori-iskujen jälkeen räjähteiden havaitsemisjärjestelmistä on tullut osa kaikkia Yhdysvaltojen lentoasemia. Nämä järjestelmät perustuvat moniin eri tekniikoihin, joista monet perustuvat GC-MS:ään. FAA on hyväksynyt vain kolme valmistajaa toimittamaan näitä järjestelmiä. Ensimmäinen on Thermo Detection (entinen Thermedics), joka valmistaa EGIS-järjestelmää, joka on GC-MS-pohjainen räjähdysaineilmaisin. Toinen on Barringer Technologies, jonka Smith's Detection Systems nykyään omistaa. Kolmas on Ion Track Instruments (osa General Electric Infrastructure Security Systems -yhtiötä).

Elintarvikkeiden, juomien ja hajusteiden analysointi

Elintarvikkeet ja juomat sisältävät paljon aromaattisia yhdisteitä, joista osa on luonnostaan raaka-aineissa ja osa muodostuu jalostuksen aikana. GC-MS:ää käytetään laajalti näiden yhdisteiden, kuten esterien, rasvahappojen, alkoholien, aldehydien ja terpeenien, analysointiin. Sitä käytetään myös havaitsemaan ja mittaamaan pilaantumisen tai väärentämisen aiheuttamia epäpuhtauksia, jotka voivat olla haitallisia. Viranomaiset valvovat usein epäpuhtauksia, esimerkiksi torjunta-aineita.

Astrokemia

Useat GC-MS:t ovat lähteneet maasta. Kaksi lähti Marsiin Viking-ohjelmassa. Venera 11 ja 12 sekä Pioneer Venus analysoivat Venuksen ilmakehää GC-MS:llä. Cassini-Huygens-ohjelman Huygens-luotain laskeutui yhdellä GC-MS:llä Saturnuksen suurimpaan kuuhun Titaniin. Rosetta-missio analysoi komeetta 67P/Churyumov-Gerasimenkon materiaalia kiraalisella GC-MS:llä vuonna 2014.

Lääketiede

GC-MS:ää käytetään vastasyntyneiden seulontatesteissä. Näillä testeillä voidaan löytää kymmeniä synnynnäisiä aineenvaihduntasairauksia (tunnetaan myös nimellä synnynnäinen aineenvaihduntavirhe). GC-MS:llä voidaan määrittää yhdisteitä virtsasta jopa hyvin pieniä määriä. Näitä yhdisteitä ei normaalisti esiinny, mutta niitä esiintyy aineenvaihduntahäiriöistä kärsivillä henkilöillä. Tästä on tulossa yleinen tapa diagnosoida IEM, jotta diagnoosi voidaan tehdä aikaisemmin ja hoito aloittaa. Tämä johtaa lopulta parempaan lopputulokseen. Nyt on mahdollista testata vastasyntyneeltä yli 100 geneettistä aineenvaihduntahäiriötä syntymän yhteydessä tehtävällä virtsatestillä, joka perustuu GC-MS:ään.

GC-MS:ää käytetään aineenvaihdunnan aktiivisuuden määrittämiseen yhdessä aineenvaihduntayhdisteiden isotooppimerkinnän kanssa. Useimmat sovellukset perustuvat ¹³C:n käyttöön leima-aineena ja ¹³C-C-suhteiden¹² mittaamiseen isotooppisuhdemassaspektrometrillä (IRMS). IRMS on massaspektrometri, jossa on detektori, joka on suunniteltu mittaamaan muutamia valikoituja ioneja ja palauttamaan arvot suhteina.